一文读懂基因检测：癌症病人在做完DNA检测后，为什么还要再做RNA测序？

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为什么做完了DNA检测，还需要做RNA检测？RNA检测有什么必要性吗？今天小编就来具体谈谈，关于RNA检测是否有必要；能够检出靶向融合的机率有多大；应该选择怎样的平台。这些问题仍然有很多误区或者不够清晰的方面。

对于实体瘤在确诊后要进行基因突变检测，寻找可能的治疗靶点这一概念，相信无论是肿瘤医生还是患者都有一致的认识，尤其是肺癌、直肠癌、乳腺癌、胃癌，胃肠间质瘤等常见的、有明确靶点的癌肿。

PART 1.RNA检测的必要性

以肺癌为例。肺癌是靶点及靶向药种类最多的癌症，肺癌8基因panel（包括EGFR, KRAS, ALK1, BRAF, ROS1, RET, MET和ERBB2）是目前几个国际指南联合推荐的。

然而, 这些基因突变的总和占到肺癌总病例数的45-50%左右，仍然有50%或者更多的病人无法找到靶点，进而得到相应的靶向治疗。

美国纪念斯隆凯特琳癌症中心分子病理的专家团队评估了靶向 DNA 测序 (DNAseq) 驱动基因变异阴性的肺癌中，RNA 测序 (RNAseq)在鉴定基因融合和 MET 基因14号外显子(METex14)跳跃突变中的显著优势。

该团队先使用获得FDA批准的DNA靶向测序MSK-IMPACT，涵盖400-468个基因的所有外显子及部分基因的内含子区域，对2522例肺癌进行了DNA层面的变异检测。

驱动基因突变阴性的肺癌再使用定制的 RNAseq (MSK-Fusion) 做进一步分析。DNA测序检出了195 例（7.7%）融合和119 例（4.7%）MET 14号外显子变异， 占所有肺癌标本的12.5%。

在254例驱动基因检测阴性、且有足够材料用于 RNAseq测试的病例中，14% (36/254)的病例有新的发现，其中 33 例适用靶向治疗（27 例融合，6 例 MET 14号外显子跳跃突变）。

33 名患者中有10 名随后接受了匹配的靶向治疗，其中 8 名（80%）显示出临床获益。另外，这一研究还发现，肿瘤突变负荷（TMB）低的肺癌明显比TMB高的肺癌有更高的融合阳性率（31%vs. 7%）。

因此，如果肺癌患者在DNA检测层面缺乏驱动基因突变，同时突变负荷低 [0-5 个突变/兆碱基 (mut/Mb)] 更应考虑进行RNAseq检测。

PART 2. 在检测基因融合时，为什么RNA层面的检测更敏感

基于DNA 的肿瘤测序对点突变及小片段插入缺失相对敏感，有的大panel还可以检测拷贝数改变，微卫星不稳定性及肿瘤突变负荷。

但是DNA测序在检测基因融合的方面存在技术方面的限制：

（1）DNA检测在识别发生在较短内含子中的基因融合时还具有一定可操作性，但是一些临床上重要的融合往往来自于非常长的内含子区域。如果在设计DNA panel时将这些大的内含子包括的话，必将显著损害panel中其余基因的覆盖率。这样不仅增加测序成本，还会影响测序的敏感性。因此多数DNA panel对融合基因的检测都很难做到全面；

（2）一些内含子中的重复序列元素，也存在于基因组的其它地方，因此无法通过DNA测序所获得的短的读取序列来评估。短的序列难以对此类片段进行唯一定位就会导致某些内含子的覆盖范围出现空白，从而使得潜在重排断点区域出现检测盲点；

（3）DNA 测序分析无法提供直接证据表明重排产生了在 mRNA 表达水平的融合，这是基因组 DNA 水平上检测重排所无法回答的特殊问题。与DNA测序相对应的基于 RNA水平检测的实体瘤融合panel，可以用特定的技术来更为有效地检测基因融合。

RNA测序的优势体现于：

1.内含子在RNA水平已经被剪切掉，因此只需要根据两个融合外显子的序列来设计检测方案；

2.RNA检测融合基因在mRNA水平的表达，而且这一表达极有可能高于在DNA水平的拷贝数。

3. 有的RNA检测，比如纪念斯隆凯特琳的RNA融合panel (MSK-Fusion),使用多重PCR巢式扩增，添加分子标签，只需要对融合基因的一端针对性设计，就可以将另一端的融合基因捕获。这些优势使得RNA检测融合时不仅较DNA检测有更好的敏感性及特异性，也能从表达水平反映这些融合是否有可能的致癌性。

PART 3. 如何选择RNA检测

目前，多数的临床实验室使用的RNAseq是基于靶向扩增进行的，其中包括有限数量的基因，且只针对这些基因中可能参与融合的外显子设计引物。

这样的靶向 RNAseq panel 检测就有可能遗漏了尚未描述但可能具有临床意义的基因融合。如果有必要有条件，可以通过其它测序方法做额外检测，包括基于靶向杂交捕获的 RNAseq 或全转录组测序。

PART 4. RNA检测需要的肿瘤组织

随着检测技术的改进与发展，以前只能用新鲜或者冷冻组织进行的RNA测序，目前普遍可以用常规的病理组织蜡块或者切片来进行。

因此，在做DNA检测时，要考虑到后续可能会再做RNA检测，要尽可能预留一些标本。

也可以改良核酸的提取方法，能够同时提取DNA及RNA；或者先提取DNA, 下一步要进行RNA检测时再从同一标本中继续提取RNA。

总结

在肿瘤基因变异检测时，应使用综合 的DNA 测序和RNA 测序。这两者可以同时进行，但是出于经济上的考虑，多数患者会做序贯性的检测。

只在DNA检测没有找到驱动基因的靶向突变时，才会进一步做RNA的检测。当DNA测序检测到的肿瘤突变负荷低时，使用RNA测序更容易检测到融合基因。

在做RNA检测前，医生及患者都需要对这个检测有一定了解，尤其是明白这项检测的局限性。目前在肺癌中有较为明确的可能会有10-15%的病人能找到可靶向治疗的融合或基因变异，其它肿瘤中还需要更多的研究与临床实践。